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Sequencing failure 는 sample의 준비 상태나 composition의 특이성에 기인하는 것이 대부분이며 이는 동일한 sequencing process 상의 어떤 조작으로도 개선 가능성이 없으므로 마크로젠의 sequencing 정책상의 재반응 대상에서 제외됩니다. User의 sequencing data에 대한 이해를 돕고자 problem 양상을 정리하였습니다. 마크로젠 sequencing service재반응의 취지는 machine error나 operator의 mishandling 가능성에 대한 확인 작업이며, 개선의 여지가 있다고 판단되는 것들에 한해 실시됩니다. 따라서 동명이라고 할지라도 다시 새로운 batch의 샘플을보내는 것은 재반응으로 간주될 수 없으며, template preparation이나 composition에 기인한 다음에 언급되는 failure 들은 모두 전액 청구함을 원칙으로 하고 있습니다. 양상 * Peak 의 모양이 불규칙하며, 마치 mixed peak 인 것처럼 보일 수도 있습니다. 그러나, 이것은 정상적인 peak 이 아니며, noise signal입니다. * Signal strength가 500 이하입니다. 원인 * Sample DNA 농도가 너무 낮기 때문입니다. * 시퀀싱에 사용한 프라이머의 농도가 너무 낮거나 Tm 값이 적절하지 않기 때문입니다. * 시퀀싱에 사용한 프라이머의 binding site가 샘플 DNA 시퀀스 내에 없기 때문입니다. 대책 * 좋은 시퀀싱 결과를 얻기 위해 필요한 샘플 DNA 농도는 다음과 같습니다. Plasmid DNA (high copy number) ; 100-150 ng/ul PCR product ; 25-50 ng/ul Agarose gel에서 샘플의 농도를 가늠하실 때는, 샘플 DNA "1ul" 를 1% agarose gel 에 running 하셨을 때,    band가 보이는 것을 확인해 주시기 바랍니다. * 시퀀싱에 사용하실 프라이머는 5 pmole/ul 또는 10 pmolu/ul의 농도로 보내 주시기 바랍니다. * 시퀀싱 리액션의 anneling temperature 는 50℃(단일조건) 이므로 Tm은 55-60℃ 를 권장합니다. * 시퀀싱에 사용하고자 하는 primer의 binding site가 샘플 DNA 시퀀스 내에 있는지 확인합니다. * 샘플이 플라스미드인 경우, 시퀀싱에 사용하고자 하는 primer의 시퀀스를 vector 시퀀스와 match 시켜 봄으로써 primer binding site의 존재 여부를 확인합니다. * 특히 M13R 프라이머와 M13R-pUC(-40) 프라이머의 경우, vector 제조사에 따라 이름을 혼용하므로, 반드시 프라이머의 sequence 가 샘플 시퀀스 내에 있는지 확인하시는 것이 좋습니다. Primer M13R ; GCGGATAACAATTTCACACAGG Primer M13R-pUC(-40) ; CAGGAAACAGCTATGAC * 간혹 primer의 binding site가 손상되어 primer binding 하지 않아, signal 이 없는 경우가 있습니다. 이 때는 대체 프라이머로 시퀀싱해 보시는 것이 좋습니다. Figure1. No Signal 양상 * 샘플이 plasmid인 경우, vector 부분까지는 깨끗한 peak을 보이나 insert가 시작되는 지점부터 multi peak으로 나타납니다. * 샘플이 PCR product 인 경우, non-specific PCR product의 특성에 따라 다음과 같은 양상을 보입니다. 비슷한 사이즈의 non-specific PCR product 가 섞여 있는 경우 ;     시퀀스 시작 부위부터 끝까지 multi peak을 보입니다. 이처럼 원하는 PCR product 와 비슷한 사이즈일 경우,     agarose gel 에서는 분리되지 않아 single band로 보일 수 있습니다. Insetion/ deletion 을 포함하는 non-specific PCR product 가 섞여 있는 경우 ;     앞부분은 깨끗한 single peak 을 보이나, insertion/deletion 이 일어난 지점 이후부터 multi peak으로 나타납니     다. 이러한 경우, 일반적으로 원하는 PCR product 와 몇 base 차이의 비슷한 사이즈이기 때문에, agarose gel     에서는 분리되지 않아 single band로 보일 수 있습니다. 원인 * Plasmid DNA preparation시 두 개의 colony가 동시에 picking 되었기 때문입니다. * PCR product에 non-specific PCR product 가 섞여 있기 때문입니다. 대책 * 샘플 DNA를 새로 준비하시는 것을 추천합니다. Figure2. Mixed Template 양상 * 특정 지점 이후부터 multi peak 이 나타납니다. 원인 * Secondary structure에 의해 electrophoretic mobility가 서로 다른 사이즈의 fragments를 형성하게 되면서 특정 지점 이후로 서로 다른 peak이 동시에 detection 되어 multi-peak을 나타내는 현상입니다. 드물지만 high G/C content 또는 high A/T content region에서 이러한 현상이 일어나기도 합니다. 대책 * 반대방향 primer로 진행하여 결과가 개선이 되는지 확인해 보아야 합니다. Figure3. Compression 양상 * Good signal strength를 가지면서 서로 다른 position으로 multi-peak이 나타나는 양상을 말합니다. 원인 * 하나의 template지만 해당 primer의 binding seqeunce 가 우연히 두 곳 이상에 존재하여 primer가 multiple binding 하게 됩니다. * 서로 다른 두 개 이상의 template가 섞여있을 경우도 이에 해당합니다. 비슷한 사이즈의 PCR product 2개가 섞여 있을 경우, agarose gel 에서 single band 처럼 보일 수 있습니다. 대책 * Primer를 길게 디자인 하거나, multi-binding 하지 않는 primer를 새로 디자인해야 합니다. * 다른 방향 Primer로 진행해 보는 것도 도움이 될 수 있습니다. * 만약 비슷한 사이즈의 product가 두 개 이상 섞여있을 경우에는 PCR 조건을 좀더 optimization 하여 다시 PCR 하시는 것이 좋습니다. Figure4. Multiple Binding 양상 * Long homo-polymer region 뒤쪽으로 mixed peak이 나타나는 현상을 보입니다. 원인 * Polymerization 되는 동안 homopolymer region이 올바르게 pairing 되지 않기 때문입니다. 대책 * 양방향으로 시퀀싱을 시도합니다. 예를 들어 Slippage 양상이 reverse primer를 사용했을 때 보였다면, forward 방향으로 시퀀싱을 시도해 봅니다. * Homopolymer region을 피해 새로운 primer를 디자인하여 다시 sequencing을 진행합니다. Figure5. Homopolymer region-poly A 양상 * 정상적인 sequencing data 에서 부분적으로 1 base가 double peak으로 나타나는 양상을 의미합니다. 원인 * SNP 일수도 있고 드물지만 point mutation의 경우 이런 양상을 보입니다. 대책 * base calling 자체에 의심이 될 경우 여러 번 진행 후 결과를 비교해 보는 것을 추천합니다. Figure6. Mixed Base 양상 * 작은 peak이 background처럼 전체적으로 나타납니다. * Major peak 바로 앞에 그 major peak과 같은 base의 낮은 peak이 존재합니다. 원인 * 합성 중 primer 정제가 올바르게 되지 않았거나 primer가 degradation 된 경우 나타납니다. * 샘플상의 primer binding site가 부적합할 경우에도 이런 양상을 보일 수 있습니다. * 샘플상의 primer binding site 가 부적합니다. 대책 * Primer를 다시 합성하여 sequencing을 진행하면 깨끗한 결과를 얻을 수 있습니다. * Degradation 여부를 확인하고 싶으면 마크로젠에 MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) 측정을 의뢰할 수 있습니다. (대체로 6개월에서 1년정도 된 oligo의 경우 degradation 여부를 확인 후 사용하시거나, 재합성하여 사용하시는 것이 좋습니다.) Figure7. N-1 Primer 양상 * 특정 지점 이후부터 N-1 primer 양상과 동일한 minor peak을 보입니다. * N-1 primer과 다른 점은 N-1 primer의 경우는 primer binding 직후부터 N-1 peak을 보이는 반면 frameshift mutation 의 경우에는 중간부터 이러한 양상이 나타납니다. 원인 * Template DNA에 하나 혹은 그 이상의 base가 더해지거나 삭제되어 한 샘플 안에 실질적으로 여러개의 product 가 존재하기 때문입니다. 대책 * 샘플 DNA를 새로 준비하셔야 합니다. Figure8. Frameshift Mutation (PCR samples) 양상 * Repetitive sequence (2 or more base가 반복되어 나타남)로 인해 뒤쪽의 peak이 겹치는 현상입니다. 원인 * Repetitive sequence로 인해 그 이후로 polymerase processing이 원활하지 못하게 되거나 secondary structure 등을 형성 하기 때문인 것으로 보고되고 있습니다. 대책 * 마크로젠의 Difficult Sequencing Service를 이용합니다. 참고로 마크로젠의 Difficult Sequencing Service는 high GC sequence 나 unusual secondary structure 등으로 인한 signal 감소 및 갑작스런 loss에 특화된 서비스입니다. http://www.macrogen.com/kor/sequencing/dna.jsp 를 참고하세요. Figure9. repeat-[GA] 양상 * Peak이 갑작스럽게 멈추거나 빠르게 낮아지면서 그 이후의 data를 얻을 수 없습니다. 원인 * Secondary structure가 샘플 내에 존재합니다. 대책 * 해당결과의 반대방향으로 시퀀싱을 진행해봅니다. * 마크로젠의 Difficult Sequencing Service를 이용합니다. 참고로 마크로젠의 Difficult Sequencing Service는 high GC sequence 나 unusual secondary structure 등으로 인한 signal 감소 및 갑작스런 loss에 특화된 서비스입니다. http://www.macrogen.com/kor/sequencing/dna.jsp 를 참고하세요. Figure10. Abrupt Signal Loss 양상 * 보통 50bp 에서 140사이의 위치에서 하나 혹은 두개의 픽들이 넓고 지나치게 강하게 나타납니다. 원인 * 샘플의 양을 농도에 맞게 적절하게 사용하지 않았을 때 보일 수 있습니다. * 샘플의 농도가 낮아 최대 볼륨으로 넣고, 시퀀싱 리액션을 진행했으나, 여전히 signal strength가 낮을 때, 보일 수 있습니다. * Clean-up 과정에서 소량 남은 Big Dye가 큰 dye blob peaks 으로 나타납니다. 대책 * Gel electrophoresis 와 spectrophotometer 측정을 통해 시퀀싱에 필요한 샘플의 농도를 맞추어 준비 합니다. Figure11. Dye Blob

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